1. 在室温以 300 x g 离心 5 分钟。
2. 轻轻吸走上清液，注意不要扰动细胞团。
3. 用血清学吸管以 1 mL 的细胞冻存液重悬细胞，打散细胞团时。
4. 用 2 mL 的血清学吸管将 1 mL 的细胞转移到标记好的冻存管中。
5. 用以下方法冻存细胞:
推荐使用缓速降温方法，每分钟降低 1 度，随后可以在 -196°C 液氮长期保存。不推荐在-80°C 长期保存。
逐步降温法：-20°C 保存 2 个小时，然后 -80°C 中保存 2 个小时，随后可以在 -196°C 液氮中长期保存。
二. 解冻
解冻后，应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。
开始之前，提前准备好以下材料：试管，恢复至室温的培养基，预先包被的培养板，确保整个解冻复苏程序可以在最短的时间内完成。注意：不要在 37°C 水浴中加热培养基。
1. 在 37°C 水浴中快速解冻，持续温和的在水中晃动冻存管，直到剩余少量细胞还处于结 冰状态。
2. 水浴中取出冻存管，用 70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。
3. 用 2 mL 的血清移液管把细胞悬液转移到一个 15 mL 的锥形试管。
注意：用 2 mL 的血清移液管代替 1 mL 的枪头可以减少细胞聚集体的分解。
4. 逐滴加入 5 - 7 mL 的预热的培养基到 15 mL 的离心管中，加入的同时轻轻混匀。
5. 室温以 300 x g 离心 5 分钟。
6. 吸出培养基，使细胞沉淀完好无损。使用 2 mL 血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于 1 mL的培养基中。
7. 将 0.5 mL 的细胞混合物转移到含有培养基的预包被的 6 孔板的培养孔中（例如，每个冻冻管可以铺板两个孔）。
8. 将培养板放入 37°C 培养箱。快速前后左右的摇晃培养板数次，将细胞聚集体分布均匀。24 小时内不要移动培养板。
9. 每天换液，目测培养物以评估生长状态直到下一次传代。解冻复苏后的 6 - 7 天，查看是否有适合传代的（中心致密的）未分化的集落。
注意：解冻复苏后如果只能观察到少数的未分化的集落，只选取这些未分化的集落进行传代，并将它们铺板至相同大小的新包被的培养孔（不进行稀释传代）。
